基礎生化学実験 / 第 1 回

実験I：タンパク質の定量（Bradford法）

实验I：蛋白质定量（Bradford法）

基礎生化学実験 🔑 難易度 ★★☆ 📌 Bradford法・CBB G-250・検量線・595nm

📌 課題・試験に出そう课题 / 考试要点

レポート別紙の課題：①Bradford 法を妨害する物質を挙げよ（例：SDS などの界面活性剤、強アルカリ）。②Bradford 法以外の紫外吸収法（280 nm・芳香族アミノ酸）・BCA 法の原理と特徴を Bradford 法と表で比較せよ。③タンパク質を変性させる要因を複数挙げよ（熱・極端なpH・有機溶媒・尿素やグアニジン・重金属・界面活性剤などから）。④変性を利用した食品を1つ挙げ、どんな変性か説明せよ（例：ゆで卵＝熱変性、ヨーグルト／チーズ＝酸変性）。
レポート本文：BSA と γグロブリンの検量線の傾きに差があったか、あればなぜかを考察する。报告附页课题：①列出妨害Bradford法的物质（如SDS等界面活性剂、强碱）；②把紫外吸收法（280nm·芳香族氨基酸）·BCA法的原理与特点与Bradford法列表比较；③列出多个使蛋白变性的因素（热·极端pH·有机溶剂·尿素或胍·重金属·界面活性剂等）；④举一个利用变性的食品并说明何种变性（如水煮蛋＝热变性、酸奶/奶酪＝酸变性）。报告正文：BSA与γ球蛋白检量线斜率是否有差、若有为何，加以讨论。

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本講のポイント本课重点

Bradford 法：色素 CBB G-250 が酸性条件下でタンパク質に結合し、赤色→青色に変わる。この色変化を 595 nm の吸光度で測る。Bradford法：染料CBB G-250在酸性下与蛋白结合，由红变蓝；用595nm吸光度测。

標準タンパク質は ウシ血清アルブミン（BSA）とヒト血清γグロブリンの2種。200 µg/mL 原液から 25・50・100・200 µg/mL を調製して検量線を作る。标准蛋白用BSA（牛血清白蛋白）和人血清γ球蛋白2种；从200µg/mL原液配25·50·100·200µg/mL做检量线。

各 1.5 mL チューブに試料 50 µL ＋ Bradford 試薬 950 µL（計 1 mL）。よく攪拌して室温で5分間以上放置してから測定。每管：试料50µL+Bradford试剂950µL（共1mL）；充分搅拌、室温放置≥5分钟再测。

検量線は2種類のタンパク質を1つのグラフに描く。BSAとγグロブリンで傾きが異なる点に注意。检量线把2种蛋白画在同一张图；注意BSA与γ球蛋白斜率不同。

未知試料 X・Y は、教員が種類を明かした後、対応する検量線を使って濃度を求める。未知样品X·Y在老师告知种类后，用对应检量线求浓度。

CBB G-250＝Bradford 用、CBB R-250＝実習5（SDS-PAGE）の染色用。混同しない。CBB G-250用于Bradford，CBB R-250用于实习5（SDS-PAGE）染色，别混。

❓ この回で答えたい問い / 这节要解决的问题

濃度未知のタンパク質溶液の濃度を、Bradford 法でどう決めるのか？

怎样用Bradford法测定浓度未知的蛋白质溶液的浓度？

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講義の流れ这节课老师一步步讲了什么

🟢 緑＝重要 / 绿色=重点○ 淡色＝流れ / 淡色=过程💬 灰＝余談 / 灰色=老师的闲话枝节

① 目的：タンパク質を測る

タンパク質を扱う実験で最も基本的な作業は「量（濃度）を測る」こと。本実習では一般的な Bradford 法を学ぶ、と確認した。蛋白实验最基本的是测量（浓度）；本实习学常用的Bradford法。

② 原理：CBB G-250 の色変化

色素 CBB（クマシーブリリアントブルー）には G-250 と R-250 があり、CBB G-250 は酸性条件でタンパク質に結合すると赤色から青色へ変化する。これを利用して定量する。CBB有G-250和R-250；CBB G-250在酸性下结合蛋白时由红变蓝，据此定量。

③ 標準液を調製

200 µg/mL の BSA・γグロブリン原液から、20/40/80 µL を取り蒸留水で計160 µL にして 25・50・100 µg/mL を作る（200 µg/mL は原液そのまま）。用200µg/mL的BSA·γ球蛋白原液取20/40/80µL，加蒸馏水补到160µL，配25·50·100µg/mL（200µg/mL用原液）。

④ 反応液をつくる

11本のチューブ（水・BSA 25/50/100/200・γ 25/50/100/200・X・Y）に試料を 50 µL ずつ、続けて Bradford 試薬を 950 µL ずつ入れる。11管（水·BSA25/50/100/200·γ25/50/100/200·X·Y）各加试料50µL，再各加Bradford试剂950µL。

⑤ 攪拌して発色を待つ

ボルテックスでよく攪拌し、室温で5分間以上放置して色を安定させる。涡旋充分搅拌，室温放置≥5分钟让显色稳定。

⑥ A595 を測定

キュベットに移し、分光光度計で 595 nm の吸光度を測る。測定後は液をチューブに戻す。水（ブランク）でゼロ点を取る。移入比色皿，分光光度计测595nm吸光度；测后把液倒回管中；用水（空白）调零。

⑦ 検量線を作る

標準液の濃度（横軸）と A595（縦軸）から検量線を作る。BSA と γグロブリンの2本を同じグラフに描く。用标准液浓度（横轴）和A595（纵轴）做检量线；BSA和γ球蛋白2条画在同一图。

⑧ 未知濃度を決定

教員が X・Y のタンパク質の種類を明かすので、対応する検量線を使って A595 から濃度を読み取る。老师告知X·Y的蛋白种类，用对应检量线由A595读出浓度。

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知識マップ知识图谱（先看这张抓全局）

Bradford 法で定量用Bradford法定量

原理（CBB G-250）原理（CBB G-250）

酸性で結合酸性下结合

赤→青に変化由红变蓝

A595で測る测A595

標準液标准液

BSA牛血清白蛋白

ヒト血清γグロブリン人血清γ球蛋白

200→25/50/100/200200稀释到25/50/100/200

操作操作

試料50+試薬950µL试料50+试剂950µL

室温5分以上室温≥5分钟

ブランクは水空白用水

検量線と課題检量线与课题

2タンパク質を1図に2蛋白画一图

傾きが違う理由斜率不同的原因

妨害物質・変性妨害物质·变性

← → 横にスクロールできます／可左右滑动

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未知濃度を出すまで求出未知浓度的流程

① 標準液を希釈調製

200 µg/mL から 25/50/100 µg/mL を作る。由200µg/mL配25/50/100µg/mL。

② 反応させる

試料50µL＋Bradford試薬950µLを混ぜる。试料50µL+Bradford试剂950µL混合。

③ 発色を待つ

室温で5分以上置く。室温放置≥5分钟。

④ A595を測る

ブランク（水）でゼロ合わせして測定。用水空白调零后测595nm。

⑤ 検量線で換算

対応する検量線でA595→濃度。用对应检量线把A595换成浓度。

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解説详细讲解

Bradford 法の原理 Bradford法的原理

色素 クマシーブリリアントブルー（CBB）には、わずかに構造の異なる G-250 と R-250 の2種類がある。CBB G-250 は酸性条件下でタンパク質に結合すると赤色から青色へ変化する。この色変化（595 nm 付近の吸光度の増加）を利用してタンパク質濃度を測るのが Bradford 法である。濃度を求めるには、濃度既知の標準タンパク質で検量線（標準曲線）を作る必要がある。CBB有G-250和R-250两种；CBB G-250在酸性下结合蛋白时由红变蓝，用595nm吸光度的增加来测浓度。求浓度需用已知浓度的标准蛋白做检量线。

標準液の調製（指針書の表） 标准液配制（指针书表）

標準液の濃度 (µg/mL)	25	50	100
200 µg/mL タンパク質溶液 (µL)	20	40	80
蒸留水 (µL)	140	120	80

BSA と γグロブリンそれぞれで上表のとおり調製する（合計 160 µL）。200 µg/mL は原液をそのまま使う。BSA和γ球蛋白各按上表配制（共160µL）；200µg/mL用原液。

反応と測定 反应与测定

11本のチューブ（水・BSA-25/50/100/200・γ-25/50/100/200・X・Y）に各 試料 50 µL、続けて Bradford 試薬 950 µL を加える。ボルテックスで攪拌し、室温で5分間以上放置後、分光光度計で 595 nm の吸光度を測定する（ブランクは水）。11管各加试料50µL，再加Bradford试剂950µL；涡旋后室温放置≥5分钟，用595nm测吸光度（空白为水）。

標準液の濃度 vs A595 ⇒ 検量線 ⇒ 未知 X・Y の A595 から濃度を決定

レポートでは、BSA と γグロブリンの検量線の傾きの差とその理由を考察する。傾きが違うのは、色素の結合量がタンパク質のアミノ酸組成（塩基性・芳香族残基など）に依存し、タンパク質ごとに異なるため。これは Bradford 法の弱点でもある。报告需讨论BSA与γ球蛋白检量线斜率的差异及原因：染料结合量取决于蛋白的氨基酸组成（碱性·芳香族残基等），各蛋白不同——这也是Bradford法的弱点。

✏️

例題を一緒に解く手把手例题（跟着算一遍）

問：200 µg/mL の BSA 原液から 25 µg/mL の標準液（160 µL）を作るには、原液と蒸留水を何 µL ずつ取るか？由200µg/mL的BSA原液配25µg/mL标准液（160µL），原液和蒸馏水各取多少µL？

必要な原液量：\( 160 \times \dfrac{25}{200} = 20\,\mu\mathrm{L} \)。需原液：160×25/200=20µL。

蒸留水：\( 160 - 20 = 140\,\mu\mathrm{L} \)。蒸馏水：160−20=140µL。

→ 原液 20 µL ＋蒸留水 140 µL（指針書の表と一致）。→原液20µL+蒸馏水140µL（与指针书表一致）。

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つまずきポイント容易错的地方

❌ どのタンパク質でも同じ1本の検量線で定量できる

✅ 色素の結合量はタンパク質ごとに違い検量線の傾きが異なる。X・Y は種類に対応する検量線を使う

误：任何蛋白都用同一条检量线 → 对：各蛋白染料结合量不同、斜率不同；X·Y要用对应种类的检量线

❌ 界面活性剤が入っていても問題なく測れる

✅ SDS などの界面活性剤は Bradford 反応を妨害するので避ける（課題①の妨害物質）

误：含界面活性剂也能测 → 对：SDS等界面活性剂会妨害Bradford反应，应避免（课题①的妨害物质）

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基礎問題基础理解题（这些懂了就过关）

基礎Bradford 法で吸光度を測る波長は？Bradford法测吸光度的波长是？

595 nm。595 nm。

基礎Bradford 法に使う CBB は G-250 か R-250 か？Bradford法用的CBB是G-250还是R-250？

CBB G-250（R-250 は実習5の SDS-PAGE 染色用）。CBB G-250（R-250用于实习5的SDS-PAGE染色）。

基礎標準タンパク質として使う2種類は？用作标准蛋白的两种是？

ウシ血清アルブミン（BSA）とヒト血清γグロブリン。牛血清白蛋白（BSA）和人血清γ球蛋白。

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発展問題进阶题

発展BSA と γグロブリンの検量線の傾きが違うのはなぜか？为何BSA与γ球蛋白的检量线斜率不同？

CBB の結合量はタンパク質のアミノ酸組成（塩基性・芳香族残基など）に依存し、タンパク質ごとに異なるため。Bradford 法の弱点。CBB结合量取决于蛋白氨基酸组成（碱性·芳香族残基等），各蛋白不同；这是Bradford法的弱点。

発展未知試料 X・Y の濃度はどう決めるか？未知样品X·Y的浓度怎么定？

教員が明かした X・Y のタンパク質の種類に対応する検量線を使い、その A595 から濃度を読み取る。用老师告知的X·Y蛋白种类对应的检量线，由其A595读出浓度。

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