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基礎生化学実験 / 第 2 回

実験II：SDS-PAGE によるタンパク質の分離

实验II：用SDS-PAGE分离蛋白质
基礎生化学実験 🔑 難易度 ★★☆ 📌 電気泳動・SDS・分子量・CBB染色
⚠️ 安全メモ 安全提示未重合のアクリルアミドは神経毒。粉末・溶液を扱うときは手袋を着用し、皮膚に触れない・吸い込まないこと。重合後のゲルは比較的安全だが取り扱いは丁寧に。未聚合的丙烯酰胺有神经毒性。处理粉末/溶液时戴手套，勿接触皮肤、勿吸入；聚合后的凝胶相对安全，但仍小心操作。
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本講のポイント本课重点

電気泳動：タンパク質は電場で、自分の電荷と反対の電極へ移動する。电泳：蛋白质在电场中向与自身电荷相反的电极移动。
支持体はポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド＋BIS、APSとTEMEDで重合・架橋）。支持体是聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺＋BIS，用APS和TEMED聚合·交联）。
SDS（陰イオン界面活性剤）がタンパク質の立体構造を壊し、鎖あたり一定量結合 → 一様に負電荷。SDS（阴离子表面活性剂）破坏蛋白立体结构，每条链结合定量SDS→均匀带负电。
電荷の差が消えるので、移動度は分子量だけで決まる（分子量順に分離）。电荷差被抹平，迁移率只由分子量决定（按分子量分离）。
分離後は CBB（Coomassie Brilliant Blue R-250）で染色して可視化する。分离后用CBB（考马斯亮蓝R-250）染色显色。
❓ この回で答えたい問い / 这节要解决的问题
なぜ SDS-PAGE ではタンパク質が分子量の順に分かれるのか？
为什么SDS-PAGE能让蛋白质按分子量分开？
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講義の流れ这节课老师一步步讲了什么
🟢 緑＝重要 / 绿色=重点○ 淡色＝流れ / 淡色=过程💬 灰＝余談 / 灰色=老师的闲话枝节
① 電気泳動とは
タンパク質を電場に置くと電荷と反対の電極へ動く現象を電気泳動と呼ぶ、と確認した。确认电泳：蛋白在电场中向相反电极移动。
② ゲルの正体
支持体はアクリルアミドとBISの重合体（ポリアクリルアミドゲル）で、APS・TEMEDで重合が始まり架橋される。支持体是丙烯酰胺与BIS的聚合物，APS·TEMED引发聚合并交联。
③ SDSの役割
SDSは疎水部に結合してタンパク質の球状構造を壊し、ポリペプチド鎖あたり一定量結合する。SDS结合疏水部、破坏球状结构，每条链结合定量。
④ なぜ分子量順か
どのタンパク質も一様に負電荷を帯びるため電荷の差が消え、ゲルの網目を通る速さ＝分子量だけで移動度が決まる。各蛋白都均匀带负电、电荷差消失，穿过凝胶网孔的快慢只由分子量决定。
⑤ 測定と希釈
吸光度測定では溶出液を希釈（例：30倍・8倍・10倍）し、280 nm（タンパク質）や 405/409 nm で測る。ブランクは緩衝液。测吸光度时把洗脱液稀释（如30/8/10倍），用280nm（蛋白）或405/409nm测，空白用缓冲液。
⑥ 染色して読む
泳動後にCBBで染め、バンドの位置と濃さから純度や分子量を読み取る。电泳后用CBB染色，由条带位置和深浅读纯度和分子量。
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知識マップ知识图谱（先看这张抓全局）
SDS-PAGESDS-PAGE
電気泳動电泳
電場で移動电场中移动
電荷と逆の極へ向相反电极
ゲル凝胶
アクリルアミド＋BIS丙烯酰胺＋BIS
APS・TEMEDで重合APS·TEMED聚合
網目構造网孔结构
SDSの働きSDS作用
構造を破壊破坏结构
一様に負電荷均匀负电
電荷差を消す抹平电荷差
検出检测
分子量で分離按分子量分离
CBB染色CBB染色
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分子量で分かれる理由按分子量分开的原因
① SDSが結合
鎖あたり一定量のSDSが結合する。每条链结合定量SDS。
② 電荷が一様に
どのタンパク質も同程度に負電荷を帯びる。各蛋白都带同等负电。
③ 電荷差が消える
移動の差は電荷ではなくなる。迁移差异不再来自电荷。
④ 大きさで決まる
ゲルの網目を通る速さ＝分子量で移動度が決まる。穿网孔快慢＝分子量决定迁移率。
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解説详细讲解

SDS-PAGE の原理 SDS-PAGE的原理

タンパク質は電場に置くと電荷と反対の電極へ動く（電気泳動）。支持体のポリアクリルアミドゲルは、アクリルアミドと BIS（N,N'-メチレンビスアクリルアミド）が APS と TEMED により重合・架橋した網目である。蛋白在电场中向相反电极移动（电泳）。聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺与BIS经APS、TEMED聚合交联成网孔。

SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）は陰イオン性界面活性剤で、疎水部に結合してタンパク質の球状構造を壊す。ポリペプチド鎖あたり一定量が結合するので、種類によらず一様に負電荷を帯びる。SDS是阴离子表面活性剂，结合疏水部、破坏球状结构；每条链结合定量，故各蛋白都均匀带负电。

電荷の差が消える ⇒ 移動度は分子量だけで決まる

泳動後は CBB（Coomassie Brilliant Blue R-250）で染色して可視化する。タンパク質定量の Bradford 法では CBB G-250 を用いる。电泳后用CBB（考马斯亮蓝R-250）染色显色；蛋白定量的Bradford法用CBB G-250。

⚠️

つまずきポイント容易错的地方
❌ SDSがなくても分子量順に分かれる
✅ SDSがないと電荷と大きさの両方で動き、分子量順にならない
误：没SDS也按分子量分 → 对：没SDS时受电荷和大小双重影响，不会纯按分子量
❌ バンドが下にあるほど分子量が大きい
✅ 小さいタンパク質ほど速く（遠くまで）動くので、下のバンドほど分子量は小さい
误：越靠下分子量越大 → 对：小蛋白跑得快（远），越靠下分子量越小
✅

基礎問題基础理解题（这些懂了就过关）
基礎SDSの役割は何か？SDS的作用是什么？
タンパク質の構造を壊し、鎖あたり一定量結合して一様に負電荷を与える。破坏蛋白结构，每条链结合定量、使其均匀带负电。
基礎SDS-PAGE で移動度を決めるのは？SDS-PAGE中决定迁移率的是？
分子量（電荷の差は消えている）。分子量（电荷差已被抹平）。
基礎分離後の可視化に使う色素は？分离后显色用什么染料？
CBB（Coomassie Brilliant Blue R-250）。CBB（考马斯亮蓝R-250）。
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発展問題进阶题
発展ポリアクリルアミドゲルはどう作られるか？聚丙烯酰胺凝胶怎样形成？
アクリルアミドとBISが、APSを開始剤・TEMEDを触媒として重合・架橋し網目をつくる。丙烯酰胺与BIS以APS为引发剂、TEMED为催化剂聚合交联成网孔。
発展小さいタンパク質と大きいタンパク質、ゲル中で速いのは？小蛋白和大蛋白，凝胶中谁跑得快？
小さいタンパク質。網目を通りやすく、より遠くまで移動する。小蛋白；更易穿过网孔，跑得更远。
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