基礎生化学実験 / 第 1 回

実験I：酵素活性測定とタンパク質定量（PNP検量線・吸光度）

实验I：酶活性测定与蛋白质定量（PNP检量线·吸光度）

基礎生化学実験 🔑 難易度 ★★☆ 📌 吸光度・検量線・Beerの法則・分画

🎯

本講のポイント本课重点

酵素活性は基質から生じる生成物（PNP）の量を吸光度で測る。PNPは405 nmで吸収する。酶活性通过测量生成物PNP的量来定，PNP在405nm吸收。

PNP検量線：濃度と吸光度は比例（Beerの法則）。本実験では 0.01–0.05 mM で A405＝0.028–0.138、ほぼ直線。PNP检量线：浓度与吸光度成正比（比尔定律）；本实验0.01–0.05mM对应A405 0.028–0.138，近直线。

検量線の傾きは約 2.76 /mM。これで未知サンプルの吸光度→濃度に換算できる。检量线斜率约2.76/mM，可把未知样品的吸光度换算成浓度。

タンパク質量は 280 nm の吸収（芳香族アミノ酸）や色素法（Bradfordなど）で定量する。蛋白质量用280nm吸收（芳香族氨基酸）或染料法（如Bradford）定量。

各分画(#)の吸光度を測り、活性とタンパク質の溶出プロファイルを描く。测各分画(#)的吸光度，画出活性和蛋白质的洗脱曲线。

測定前にブランク（緩衝液）で装置をゼロ合わせする。测定前用空白（缓冲液）把仪器调零。

❓ この回で答えたい問い / 这节要解决的问题

酵素の活性とタンパク質の量を、吸光度からどう数値化するのか？

酶的活性和蛋白质的量，怎样从吸光度算成数值？

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講義の流れ这节课老师一步步讲了什么

🟢 緑＝重要 / 绿色=重点○ 淡色＝流れ / 淡色=过程💬 灰＝余談 / 灰色=老师的闲话枝节

① 検量線をつくる

既知濃度の PNP（0.01–0.05 mM）の A405 を測り、濃度 vs 吸光度の検量線を作成した。用已知浓度PNP（0.01–0.05mM）测A405，做浓度对吸光度的检量线。

② 直線性を確認

A405 は 0.028, 0.056, 0.083, 0.110, 0.138 とほぼ等間隔で増え、原点を通る直線になった（Beerの法則）。A405为0.028,0.056,0.083,0.110,0.138近等距递增、过原点直线（比尔定律）。

③ 分画の吸光度を測る

カラムから集めた各分画 #1〜#20 の吸光度を測定し、どの分画に酵素・タンパク質が出てきたかを調べた。测柱层析各分画#1–#20的吸光度，看酶/蛋白出现在哪些分画。

④ プロファイルを描く

分画番号を横軸、吸光度を縦軸にとると、特定の分画にピークが現れ、目的成分の溶出位置が分かる。以分画号为横轴、吸光度为纵轴，特定分画出现峰，确定目标成分洗脱位置。

⑤ 濃度に換算

検量線を使って、分画の A405 を PNP 濃度（＝酵素が作った生成物量）に換算する。用检量线把分画的A405换算成PNP浓度（＝酶生成的产物量）。

⑥ 比活性の考え方

酵素活性（生成物量）をタンパク質量で割れば比活性になり、精製の進み具合の指標になる。酶活性÷蛋白量＝比活性，是纯化进展的指标。

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知識マップ知识图谱（先看这张抓全局）

吸光度で測る用吸光度测量

検量線检量线

既知濃度のPNP已知浓度PNP

A405を測る测A405

傾き≈2.76/mM斜率≈2.76/mM

Beerの法則比尔定律

濃度∝吸光度浓度∝吸光度

直線で外挿しない不超范围外推

分画測定分画测定

#ごとに吸光度逐分画测吸光度

溶出プロファイル洗脱曲线

ピーク位置峰位置

定量と比活性定量与比活性

タンパク質は280nm蛋白用280nm

活性÷タンパク質活性÷蛋白

← → 横にスクロールできます／可左右滑动

🔗

吸光度→濃度→比活性吸光度→浓度→比活性

① ブランクでゼロ合わせ

緩衝液で装置の0点を取る。用缓冲液把仪器调零。

② 検量線を作る

既知濃度PNPのA405から直線を引く。用已知浓度PNP的A405画直线。

③ 試料を測る

各分画のA405を測定。测各分画的A405。

④ 濃度に換算

検量線で吸光度→PNP濃度。用检量线把吸光度换成PNP浓度。

⑤ 比活性を出す

活性をタンパク質量で割る。活性除以蛋白量得比活性。

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解説详细讲解

PNP検量線（本実験データ） PNP检量线（本实验数据）

PNP (mM)	0.01	0.02	0.03	0.04	0.05
A405	0.028	0.056	0.083	0.110	0.138

濃度を2倍・3倍…にすると吸光度もほぼ2倍・3倍になり、原点を通る直線（Beerの法則 A＝εcl）。傾きは約 2.76 /mM。浓度翻倍、吸光度也近翻倍，过原点直线（比尔定律 A=εcl），斜率约2.76/mM。

未知濃度 c ＝ A405 / 2.76　(mM)　（検量線の範囲内で）

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例題を一緒に解く手把手例题（跟着算一遍）

問：ある分画の A405＝0.100 だった。PNP 濃度は約いくらか？某分画 A405=0.100，PNP浓度约多少？

検量線の傾きは \( 2.76\,/\mathrm{mM} \)。检量线斜率为 2.76/mM。

\( c = A/2.76 = 0.100/2.76 \approx 0.036\,\mathrm{mM} \)。c=A/2.76=0.100/2.76≈0.036 mM。

検量線の範囲（0.01–0.05 mM）内なので妥当。範囲外なら希釈して測り直す。在检量线范围（0.01–0.05mM）内，合理；超范围要稀释重测。

⚠️

つまずきポイント容易错的地方

❌ ブランクを取らずに測定する

✅ 緩衝液でゼロ合わせしないと、吸光度に容器・溶媒の分が乗って誤差になる

误：不测空白 → 对：不调零会把容器/溶剂的吸收算进去，产生误差

❌ 検量線の範囲外でも直線とみなして外挿する

✅ 高濃度では直線から外れる。範囲外は希釈して測り直す

误：超范围也当直线外推 → 对：高浓度会偏离直线，应稀释后重测

✅

基礎問題基础理解题（这些懂了就过关）

基礎PNP は何 nm で吸光度を測るか？PNP在多少nm测吸光度？

405 nm。405 nm。

基礎検量線が原点を通る直線になる法則は？检量线过原点成直线依据什么定律？

Beerの法則（吸光度∝濃度）。比尔定律（吸光度∝浓度）。

基礎A405＝0.055 のときの PNP 濃度は約？A405=0.055时PNP浓度约？

0.055/2.76 ≈ 0.02 mM。0.055/2.76≈0.02 mM。

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発展問題进阶题

発展比活性とは何で、なぜ精製の指標になるか？比活性是什么？为何能作纯化指标？

酵素活性をタンパク質量で割った値。精製が進むと夾雑タンパク質が減り比活性が上がる。酶活性除以蛋白量；纯化推进时杂蛋白减少、比活性升高。

発展分画の吸光度プロファイルから何が分かるか？从分画吸光度曲线能看出什么？

ピークの位置から、目的の酵素・タンパク質がどの分画に溶出したかが分かる。由峰位置看出目标酶/蛋白洗脱在哪些分画。

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